前列腺特异性膜抗原是前列腺癌新辅助强化雄激素剥夺治疗后残留疾病的生物标志物

  抗PSMA是治疗后前列腺肿瘤的可靠标志物，更广泛地利用这种染色剂能够最终靠更准确地量化其残余肿瘤负担来识别将从强化辅助治疗中受益的患者。

  前列腺特异性膜抗原是前列腺癌新辅助强化雄激素剥夺治疗后残留疾病的生物标志物

  新辅助性强雄激素剥夺治疗 （iADT） 可产生广泛的组织学反应，这些反应又反映在最终的前列腺切除术标本中。准确识别和测量残留肿瘤体积对于跟踪和分层患者预后至关重要。材料和方法：本研究的目的是评估抗前列腺特异性膜抗原（PSMA）抗体在根治性前列腺切除术前接受iADT加恩杂鲁胺治疗6个月的35例患者中特异性检测残留肿瘤的能力。结果：31例患者发现残余癌，PSMA均对肿瘤反应积极。PSMA染色对肿瘤的敏感性为96%，约82%的良性区域没有反应性。相比之下，在37例未经治疗的对照队列中，PSMA对72%的良性区域有积极反应，导致肿瘤特异性为28%。PSMA进一步确定了高度去分化的前列腺癌，包括具有神经内分泌分化证据的肿瘤。结论：我们提议抗PSMA免疫染色成为iADT环境中识别残留癌症的标准化标志物。

  中高风险局限性前列腺癌的确定性治疗策略包括手术或放疗。然而，由于生化复发率 （BCR） 为 15%-30%，在手术前使用涉及激素、化疗或精准药物的新辅助治疗可改善诊断时携带微转移疾病的不利风险患者亚组的结局。1–5强雄激素剥夺疗法（iADT）将雄激素受体（AR）途径靶向药物与常规促黄体激素释放激素激动剂相结合，在转移性，新诊断的激素敏感性前列腺癌中显示出很强的疗效;iADT 是局部晚期最常用的策略之一，作为新辅助全身治疗。尽管来自近期临床试验的数据尚且还没成熟，无法确定总体生存获益，但接受新辅助 iADT 的患者的一部分患者根据相对于历史对照组预计复发的时间，显示 BCR 存在非常明显延迟。7,8事实上，“特殊应答者”（ER）患者携带最小残留疾病（MRD），或新辅助治疗后完全病理应答，其定义为最大横截面尺寸0.25-0.5cm，或0.05-0.25cm3按体积计算，3年BCR无率大于95%，因此残余癌症体积已成为新临床研究的主要结果。8作为“不完全响应者”或“无响应者”（INR，大于MRD）的定义8基于手术后对前列腺切除组织进行细致的检查，对剩余癌细胞的准确定量，建议将各种免疫染色与苏木精和曙红（H&E）染色结合使用。

  在这项研究中，我们假设针对前列腺特异性膜抗原（PSMA）的免疫组织化学（IHC）将是检测新辅助iADT后残留前列腺肿瘤的敏感和特异性标志物。我们表明，用AR靶向新辅助治疗治疗6个月的前列腺肿瘤保持高水平的PSMA表达，而良性腺体则没有。因此，与一系列未经治疗的对照相比，IHC对PSMA的治疗后肿瘤细胞的特异性几乎是其3倍。PSMA表达在经历了3种不同形式的神经内分泌分化的病例中也保留。因此，我们提议将抗 PSMA IHC 视为在新辅助 iADT 情况下测量残余癌症体积的标准组织学标志物。

  美国国立卫生研究院机构审查委员会批准在手术前收集和分析接受雄激素剥夺治疗（ADT）加恩杂鲁胺治疗的高危局限性前列腺癌患者的组织和人口统计数据（IRB方案No. 15-c-0124）。仅通过手术治疗的局限性前列腺癌患者的组织和人口统计数据的收集和分析已获得Beth Israel Deaconess医疗中心（IRB协议编号2010-P-000254/0）和Dana-Farber/Harvard癌症中心（IRB协议编号15-008和15-492）的机构审查委员会的批准。所有患者在参与前都提供了知情同意。这项研究是根据《赫尔辛基宣言》的原则进行的。

  切除后，对根治性前列腺切除术标本进行粗略检查，然后根据标准程序对固定和石蜡包埋。将五微米连续的组织切片安装在带电载玻片上进行染色或直接用于RNA的回收。固定和石蜡包埋的载玻片使用标准方案用H&E染色。如前所述，对治疗病例的残留肿瘤进行定量。10,11抗PSMA IHC使用Dak M3620在1：500稀释下进行。补充材料（）中提供了实验室方法的更多详细信息。

  将3 mm×3 mm网格覆盖在每个组织切片上，以将组织划分为方形感兴趣区域（ROI）做多元化的分析。使用HALO®图像分析平台（新墨西哥州阿尔伯克基的Indica Labs）进行网格划分。每个区域都通过PSMA染色和该区域的肿瘤存在进行分类，使用每个ROI中染色或未染色的上皮的总面积对每个网格进行单独分类，不包括腔腔空间。如果ROI内的大部分肿瘤PSMA呈阳性，并且大多数阳性是肿瘤，则该区域被归类为“真阳性”。如果ROI内的大部分肿瘤PSMA为阴性，或者如果阴性染色肿瘤多于阳性染色的非肿瘤，则该区域被归类为“假阴性”。如果一个区域的大部分染色阳性是非肿瘤的，则该区域被归类为“假阳性”。如果一个区域内没有肿瘤或染色阳性，则将其归类为“真阴性”。ROI的分类由董事会认证的专家前列腺病理学家（R.T.L.）验证。用于自动图像分析的方法在补充材料（）中提供。

  使用Mac的GraphPad Prism版本9（GraphPad Software，加利福尼亚州圣地亚哥）进行统计分析，使用Pearson或Spearman相关性测量因子之间的关联。使用Welch的t检验对治疗和未治疗的肿瘤之间，肿瘤和非肿瘤区域之间或ER和INR病例之间的单一因素作比较。使用2侧Fisher的精确检验对已治疗或未治疗的肿瘤与个体二分法因素之间的富集进行零假设检验。使用Cochran-Armitage测试进行已治疗和未治疗肿瘤之间单一因素内协变量的比较。PSMA IHC用于区分INR和ER病例的准确性使用接收器工作特性曲线进行全方位检查。统计学显著性在 p 0.05 处预先指定。对于已治疗和未治疗的病例，报告了基于网格的检测性能，置信区间为95%，通过随机抽样置换患者的2，000个自举样本的2.5%和97.5%百分位数获得。补充材料（）中提供了RNA-seq分析的详细方法。

  作为2期临床试验的一部分，我们在35名患者的队列中评估了6个月的全身性新辅助iADT后前列腺切除术标本中残留肿瘤的存在。10虽然H&E染色通常足以检测患者的大部分残留腺癌，但在一小部分病例中进行了抗NKX 3.1或PIN-4鸡尾酒（高分子量细胞角蛋白，p63和α-甲基酰基- CoA消旋酶）的IHC，用于检测单个肿瘤细胞并精确计算治疗后肿瘤体积。11常见的前列腺癌标志物前列腺特异性抗原（PSA）和AR在一部分病例中由于iADT抑制AR而显示染色减少（图1，A和B），因此在这种治疗后环境中没那么有用。在许多情况下，滑索标志物NKX 3.1的弥漫性染色鉴定出残留肿瘤（图1，A）。在几乎所有情况下，使用PSMA抗体进行免疫染色都显示出残留肿瘤的强而一致的染色（图1，A和B）。在这些治疗后肿瘤中，抗PSMA IHC在良性腺体中较弱（图1，C）。相比之下，来自未接受ADT治疗的患者的前列腺切除术标本在良性和肿瘤腺中均显示出更强的PSMA染色（图1，D）。

  图 1.前列腺肿瘤的代表性全玻片和插入显微照片。A、抗PSMA残留肿瘤阳性，抗PSA阴性，抗NKX阳性3.1。B，抗PSMA残留肿瘤阳性，抗AR弥漫性弱。C，显示的良性腺体区域与PSMA阳性残留肿瘤细胞相邻的抗PSMA阴性。D，未经治疗的前列腺切除组织，良性（顶部）和肿瘤（底部）腺体均染色阳性，以抗PSMA。显示H&E以供参考。全幻灯片图像条：5毫米;插入条：100 μm。

  鉴于PSMA蛋白的放射性标记配体现在可用于体内肿瘤定位的正电子发射断层扫描（PET），我们询问我们通过IHC检测残留肿瘤是否会模仿PSMA-PET的潜在检测。我们将每个案例缩减采样到3 mm×3 mm网格中以接近PET的分辨率，我们设计了一个简单的评分方案来系统地测试队列。这些 9 毫米2含有肿瘤的ROI区域要么被标记为PSMA阳性染色（真阳性）或未染色（假阴性;图 2，A）。同样，没有肿瘤的区域可以被PSMA染色（假阳性）或未染色（真阴性）。这种网格化方案的一个例子如图2所示，B和这种评分方法与常规的半定量H评分成比例，分别是良性和肿瘤成分（参见补充材料中的补充图，）。

  图 2.前列腺肿瘤组织评分进行PSMA染色。A、将ROI的颜色编码转换为9 mm2网 格。B、以整座治疗前列腺组织为例进行网格化和评分。C和D，来自已治疗 （C） 或未经治疗 （D） 前列腺肿瘤的代表性 ROI。插图条：100 μm。E和F，可视化已治疗 （E） 或未治疗 （F） 队列中 ROI 的分布，对每位患者进行归一化。G和H，皮尔逊从手动分析中确定的阳性染域（肿瘤和非肿瘤）的比例，每个患者，与来自处理（G）或未处理（H）队列的相同组织块的序列载玻片的本体RNA测序中FOLH1的解卷积腔细胞表达的计数的百万分之一。线% 置信区的线性回归趋势。

  在我们完成治疗的37名患者的队列中，有1个标本在处理过程中遇到延迟，不适合IHC。第二名患者接受了经尿道前列腺切除术而不是前列腺切除术，留下35个治疗的前列腺切除术标本做多元化的分析。对于对照组，我们收集了一组37名中高风险前列腺癌患者，仅通过手术治疗（表1）。然而，由于iADT试验选择的风险高于通常仅通过手术治疗的患者，因此治疗队列中较高的格里森等级组是不可避免的（表1）。每个可能分数的代表性投资回报率如图2、C和D所示。

  ERG，ETS相关基因。不适用，不适用。PTEN，磷酸酶和张力素同源物。

  韦尔奇的 t 检验。费舍尔的精确测试。Cochran-Armitage趋势测试。队列之间的主要差异是每张载玻片的肿瘤体积（表1），治疗队列中含有肿瘤的ROI要少得多（25%对41%，图2，E和F）。应用我们的视觉评分算法，治疗队列中的大多数ROI是未染色的非肿瘤（图2，E），而未经治疗的队列中最大比例的ROI是染色的非肿瘤（图2，F）。在治疗的队列中，85%的ROI显示PSMA染色对肿瘤具有特异性（图2，E），而在未经治疗的队列中为54%（图2，F）。治疗肿瘤的敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）和阴性预测值也都更高（表2）。治疗队列的总阳性染色分数（包括线%。

  95%的置信区间是根据患者水平的2，000个自举样本（带有替代样本）计算得出的。

  为了正交地证实这一发现，我们从每个块的连续载玻片（包括良性和肿瘤腺，带有基质细胞）中收集了整个组织，并进行了全转录组测序。在两个队列中对每个病例进行RNA-seq。然后将这些本体转录组解卷积以获得腔内上皮细胞特异性基因估计值，而无需区分肿瘤和良性细胞类型。在每个样本的基础上，我们将抗PSMA阳性染色评分与编码PSMA的基因FOLH1（叶酸水解酶1）的相应表达值相关联。这些关联在两个队列（图2，G和H）中均为强阳性，治疗队列的Pearson相关系数（r）为0.67（95%C.I.0.43-0.82），未经治疗的队列为0.67（95%C.I.0.44-0.81）。因此，我们对组织中PSMA蛋白表达的组织学和低分辨率估计与mRNA表达得出的值成正比，从而验证了IHC评估PSMA上皮细胞表达的准确性。

  由于治疗效果，治疗队列中含有的肿瘤总是较少，并且含有任何肿瘤的ROI的比例明显低于未经治疗的队列（图3，A，p = 0.006，Welch的t检验）。在这两个队列中，准确率和PPV与载玻片上肿瘤的数量成比例地增加（图3，B），未经治疗的肿瘤通过Pearson相关性显示出更强的比例关系（分别为r= 0.80和r= 0.92）。接下来，我们从10个不同病例中随机选择10个肿瘤和良性腺体的ROI上采用HALO自动图像分析平台，并开发了一种细胞分析算法来量化每个细胞的染色强度（图3，C）。在每 9 毫米内2ROI，单个PSMA染色的肿瘤细胞比PSMA染色的非肿瘤细胞具有更大的染色面积和染色强度（图3，D）。因此，我们的缩减采样分析更有可能低估相对于每个细胞的精确注释的准确性和特异性。

  图 3.评估影响抗PSMA检测肿瘤细胞准确性的因素。A，点图比较了Welch的t检验通过治疗和未治疗队列之间的手动分析确定的含有肿瘤的ROI的比例。线表示均值。B、皮尔逊的相关性是，抗PSMA的准确性只能识别肿瘤细胞（上图）和PPV的抗PSMA鉴定肿瘤细胞（下图）作为ROI所含肿瘤的比例的函数，通过人工分析确定。线% 置信区的线性回归趋势。C，使用HALO自动分析为每细胞分析选择的肿瘤（顶部）或非肿瘤（底部）的代表性ROI。插图条：100 μm。D，通过Welch的t检验比较每个HALO每细胞自动分析的染域（左），染色强度评分（中）和光密度（右）的点图。线表示均值。

  稳健而彻底地鉴定残留病灶对于准确定量治疗后肿瘤体积至关重要，罕见和分散的单细胞使用H&E和传统染色剂会带来严重的视觉挑战。在我们的临床试验中，INR肿瘤被定义为体积大于0.05厘米3.10这些病例通常显示散射的单细胞，其相对频率与ER肿瘤相同（残余肿瘤体积小于0.05厘米3).这些散落的细胞很容易通过抗PSMA IHC与良性腺体和基质区分开来（图4，A）。接下来，我们考虑了任何细胞类型的总PSMA染色是否会将ER与INR患者区分开来。通过手动分析测量的肿瘤和非肿瘤的联合PSMA阳性率在INR中大于ER（图4，B，p = 0.008，Welch的t-test），并且已识别出具有更大残留肿瘤体积的病例，其接收器操作特征曲线，C）。

  图 4.抗PSMA IHC检测残留肿瘤的益处。A、一种无应答者和应答者病例的代表性显微照片显示抗PSMA检测罕见的散落性残留肿瘤细胞。全幻灯片图像条：5毫米;低功耗插入条：500 μm;高功率插入条：100 μm。B，通过Welch的t检验比较ER和INR的手动分析的总PSMA阳性分数（含有PSMA阳性良性或肿瘤的ROI）。线表示均值。C、接收器工作特性曲线，用于通过手动分析确定的PSMA阳性分数的能力，以区分ER与INR病例。通过手动分析确定的肿瘤特异性抗AR核强度指数（D）或抗PSA细胞质强度指数（E）与具有肿瘤特异性抗PSMA阳性的ROI分数的Spearman相关性。线% 置信区的线性回归趋势。

  由于iADT抑制AR表达和AR活性，我们之前在Definiens（德国慕尼黑）自动定量平台上通过IHC评估了AR及其靶基因产物PSA的表达，作为治疗的直接表型结果。10相对于未经治疗的对照活检组织，抗 AR 和抗 PSA 在治疗的肿瘤中均显示组织学强度指数评分明显降低，10绝大多数病例表现为低表达或无表达。毫不奇怪，来自自动分析的这些强度评分显示，通过Spearman相关性进行视觉评分，这些强度评分与PSMA肿瘤特异性阳性没有显着关联（图4，D和E）。

  最后，我们询问抗PSMA IHC有没有检测神经内分泌分化的肿瘤的能力。在治疗队列中，我们鉴定了2例神经内分泌分化病灶：具有Paneth细胞样神经内分泌分化的腺癌（图5，A）和具有小细胞癌样特征的高级别神经内分泌癌（图5，B），两者对神经内分泌标志物突触素（SYP）表现出强烈的阳性染色，并且AR呈阴性。两者都保留了抗PSMA表达，在这些较高等级的组分中具有更多的弥漫性染色图案。我们的队列还包括一例携带两栖息癌的病例，12它保留了抗AR IHC的阳性，并且还显示出强大的抗PSMA阳性（图5，C）。因此，抗PSMA IHC能够准确地检测这些治疗难治肿瘤的差分化病灶。

  图 5.PSMA在具有神经内分泌特征的残余肿瘤中持续表达。抗PSMA，抗SYP和抗AR IHC在含有Paneth细胞样形态（A），高级别小细胞神经内分泌癌（B）或mphicrine癌（C）的残留肿瘤中。全幻灯片图像条：5毫米;低功耗插入条：500 μm;高功率插入条：100 μm。

  强烈的ADT可以在AR活性降低的情况下降低其他基因的表达。相比之下，PSMA（FOLH1基因的蛋白质产物）的上调是前列腺肿瘤对ADT的既定特异性反应。13FOLH1编码II型跨膜谷氨酸羧肽酶，在前列腺上皮细胞中表达明显较强。14PSMA表现为良性前列腺上皮、原发性癌症和大多数淋巴结转移，15与良性组织相比，在原发性前列腺肿瘤和转移性病变中表达更高。16由于AR结合位点和增强子在其位点内的差异响应，FOLH1的表达与AR活性和配体浓度成反比。13

  PSMA在晚期前列腺癌中的上调使其成为分子成像和精确分子放射治疗的理想靶标。17然而，其作为第二代 AR 轴抑制剂新辅助治疗后治疗反应标志物的效用尚未得到探索。在这项研究中，我们量化了在ADT加恩杂鲁胺6个月后，将20×全扫描玻片下采样至3 mm×3 mm ROI的背景下，肿瘤特异性抗PSMA免疫反应性的程度。部分由于AR及其配体水平不同，我们得知抗PSMA IHC对残留肿瘤具有高度特异性，但对良性腺体没有特异性。

  对于接受iADT的患者，抑制AR活性会导致治疗效果，这可能会限制常规H&E染色和标准前列腺癌IHC标志物检测MRD的效用。强烈的ADT下调许多AR调节基因，包括编码PSA的KLK3。虽然抗PSA抗体通常对检测前列腺切除组织中的前列腺肿瘤敏感，但抗PSA敏感性在抑制AR后会受一定的影响，因此对于鉴定具有治疗效果的稀有散落细胞可能不理想。18谱系标志物如NKX 3.1同样可用来医治后的肿瘤细胞检测，但对于肿瘤细胞特异性检测具有特异性，因为NKX 3.1也将在良性腺体中保持均匀表达。虽然降低的AR活性很少降低基底（p63，高分子量细胞角蛋白）或腔内（低分子量细胞角蛋白）标志物的表达，但这些标志物的表达对良性细胞并不具有特异性，萎缩良性腺体的切向切片可能是残留肿瘤的模仿者。19,20

  缩减采样的目的是使用以下任一方法近似PET成像的分辨率18F-DFCPyL 或68Ga-PSMA-11，2 PSMA-PET示踪剂于2021年被美国食品和药物管理局批准用于转移高风险患者前列腺癌的体内定位。21,22这些药物的批准是基于PSMA-PET在新诊断的局部和BCR环境中检测前列腺肿瘤的增强灵敏度，即使在多参数磁共振成像未检测到的病变中也是如此。与以前的报告一致，我们在两个队列中观察到肿瘤区域与非肿瘤相比，PSMA强度更高，但仅在治疗队列中的大多数非肿瘤ROI中不存在绝对PSMA反应性，显着增加了治疗后PSMA的特异性（表2）。这一发现凸显了PSMA成像在iADT新辅助治疗期间监测体内治疗反应的潜在用途。

  鉴于我们的发现，我们大家都希望强调这项研究的重要局限性。首先，未经治疗的队列不包括在治疗前从与治疗队列相同的患者那里获得的匹配活检，因为我们的临床研究的靶向活检方法不会对足够数量的良性腺体进行采样以进行充分和有力的比较。第二个限制是，来自未经治疗的队列的前列腺组织每张载玻片含有更大比例的肿瘤腺（图2），但我们的分析进行了调整，以考虑患者水平对肿瘤内容的影响。最后，两个队列都没有接受PSMA-PET成像，因此不可能与体内成像的放射性示踪剂进行实际关联。

  值得注意的是，人工智能驱动的努力使用抗PSMA IHC来改进用于检测已治疗前列腺肿瘤中可疑区域的算法，这是一个未满足的机会，因为PSMA对肿瘤的特异性优于许多IHC标志物。23–25目前的诊断工作继续受到非典型组织学的困扰，需要额外的专家病理学审查，这些肿瘤更有可能被自动化系统错误分类或没有专门的免疫染色。18,26在目前的研究中，我们表明，当专家前列腺病理学家使用H&E和其他确认性染色分别检查每个ROI时，单独抗PSMA IHC在检测残留疾病方面具有97%的敏感性和82%的特异性。一旦这些发现在较大的队列中得到验证，我们提议抗PSMA应被视为标准免疫组化标志物，用于识别难以检测的残留肿瘤，测量残留肿瘤体积以及评估对新辅助iADT的整体病理反应。在进行PSMA-PET的组织有限的地区，抗PSMA可能是确诊染色的可行替代方案。新辅助性 iADT（即 NCT03767244）的较大 3 期研究可能很快描述联合或不联合激素辅助治疗的新辅助治疗的无进展益处，这可能由残余癌症负担分层，测量残余肿瘤体积的准确方法仍然至关重要。

  我们在这里表明，抗PSMA是治疗后前列腺肿瘤的可靠标志物，更广泛地利用这种染色剂能够最终靠更准确地量化其残余肿瘤负担来识别将从强化辅助治疗中受益的患者。